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重编程:生物学的黑匣子

时间: 2015年03月30日 | 作者: | 来源: 环球科学(huanqiukexue.com)
几十年来,科学家已经通过重编程技术,把成体细胞逆转到胚胎状态,但这种转变是如何发生的,却一直是个迷。

 

重编程,意即把已分化的细胞逆转回胚胎状态,使其拥有可以发育成所有细胞类型的非凡能力,卵子与精子结合形成胚胎的过程也可以被看作一种重编程。从20世纪60年代,英国科学家约翰· 戈登(John Gurdon)用蝌蚪的肠道细胞培育出一只的青蛙,到1996年,伊恩· 威尔穆特(Ian Wilmut)用成体哺乳动物的细胞创造了多莉羊,重编程的研究已经走过了几十年的光阴。

 

2006年,研究人员对于重编程的兴趣迅速上升,因为研究证明,仅需转入4个基因,成熟的小鼠细胞就能被重编程,变为诱导多能干细胞(iPS)。这种方法非常简单,几乎所有的实验室都可尝试,现在该领域每年发表的论文超过1 000篇。2014年,用多能细胞修复受损或患病组织的梦想已经部分变成了现实,iPS细胞分化出的视网膜细胞被移植到患有眼疾的女性体内,这是重编程细胞首次移植到人体内。 

 

但是,没人知道这是怎么发生的,连许多专门研究重编程的科学家也解释不了。他们只知道,重编程就像生物学上的一个黑匣子,分化细胞从这头进去,多能干细胞就会从那头出来,这中间发生了什么却不得而知。日本京都大学iPS细胞研究和应用中心的分子生物学家克努特· 沃尔特詹 (Knut Woltjen)表示:“我们采用了许多研究手段,但重编程仍然令人感到困惑,我们正在做一件非常复杂的事。” 

 

干细胞生物学家指出,问题之一在于,实验材料总是细胞的混合物,其中每一个细胞的分子状态都有些许不同。制造iPS细胞的过程通常效率低下,充满变数:只有很小一部分细胞能够被完全重编程,甚至这些重编程细胞之间还有着微妙但重要的区别。更重要的是,在不同实验室中,重编程路径可能根据细胞的生长条件不同而变化,因此难以对比已知的实验结果。如果对细胞混合物的特征了解得不够,就将其用于临床则会引发安全上的担忧。 

 

不过,最近出现的新技术正在逐渐打开黑匣子。通过对单个细胞进行细致的分析、积累详细的分子数据,生物学家正在探索重编程中发生的许多重要事件。最近,规模最大的重编程研究国际合作计划——“宏伟计划”(Project Grandiose),公布了目前取得的进展。项目团队采用一系列实验,拍摄了重编程每个阶段的高精度图像,发现了多能性的另一种状态。 “这是对细胞状态随时间变化的首次高精度分析,” 项目领导者、加拿大多伦多西奈山医院干细胞生物学家安德拉斯· 纳吉(Andras Nagy)认为,“毫不夸张地说,这是一项宏伟的事业”。

 

但是,要想进一步操控这一过程,轻而易举地得到治疗性细胞,科学家还有很多工作要做。“不错,我们能获得iPS细胞,也能使它们分化,但我认为,我们还不能控制它们,”以色列魏茨曼科学研究所的干细胞生物学家雅各布· 汉纳(Jacob Hanna)说,“随心所欲地控制细胞行为听上去很酷,但要达到这个目的,我们必须获取大量资料,详细掌握细胞的分子生物学特性。”

 

从核移植到iPS 

戈登和威尔穆特在重编程青蛙和绵羊的细胞时,采用的方法几乎一致:把卵细胞的DNA剥离,植入已分化细胞的细胞核。科学家知道,卵细胞中的某些物质能使细胞核重编程,比如关闭与皮肤细胞相关的基因,而开启那些与多能性相关的基因,进而触发一系列的分子事件。在接下来的十年中,研究人员开发了各种新的重编程方式,例如向受精卵和胚胎干细胞植入细胞核,但这些方法都没能弄清楚,究竟是细胞中的什么成分启动了重编程,这个过程又是如何工作的。 

 

2006年,日本京都大学的山中伸弥(Shinya Yamanaka)和高桥和利(Kazutoshi Takahashi)制造出了iPS细胞,改变了一切。他们发现,早期胚胎或胚胎干细胞中的4种蛋白,可以重编程成体细胞,这就为研究人员提供了在培养皿中研究重编程的关键工具。现在,干细胞生物学家确信,引入这些被称作“山中因子”的蛋白后,细胞内会引发一阵强烈的、可预测的基因表达。然而,几天以后,细胞就会进入一个神秘状态:细胞会一直分裂,但一直停滞在这个状态。一周后,大概只有千分之一的细胞能成为真正的多能细胞。  

 

这个过程不可预知,我们也不可能知道最初是哪些细胞被重编程,重编程为何需要较长时间。不过,某些方面也是可以预见的。“在德国、日本和美国,研究人员可以在同样的时间以相同的速率获得iPS 细胞,”哈佛大学的亚历山大· 迈斯纳 (Alexander Meissner)指出,“我们知道这不是魔术,而是一种机制,这是个好消息,我们应该能找到它,”可是,目前进展不大,“几乎令人失望”。 

 

从细胞的角度来看,分化就像生物学上的“锁”,要逆转完全的分化状态是个巨大的挑战。我们以成纤维细胞为例,这种细胞来自皮肤的结缔组织,科学家经常用它们做重编程试验。成纤维细胞带有独特的身份印记——它们的DNA具有表观遗传学标记,比如甲基或组蛋白修饰(组蛋白与染色体结构密切相关)。因为有这些标记的存在,在正常的成纤维细胞中,只有与这类细胞相关的基因才能得以表达,否则皮肤细胞会像正在分化的干细胞,而这可能是癌症等疾病的病发途径。 

 

现在,科学家对引入“山中因子”这种强力因素之后的最初48小时非常感兴趣。在胚胎干细胞中,这些蛋白会激活“多能性网络”中的基因,让干细胞保持无限增殖的能力。但是,一旦被引入到成纤维细胞等成熟细胞中,这些蛋白的作用方式又有不同。美国宾夕法尼亚大学的细胞生物学家肯· 扎雷特(Ken Zaret)把“山中因子”引入成纤维细胞后,在最初两天内跟踪观测了这些因子的位置。结果他发现,受阻于细胞染色体的结构,“山中因子”无法接触到目标基因。 

 

相反,这些蛋白会结合到染色体的其他区域。有时,它们会激活细胞的自杀基因;有时,它们会结合到名为“增强子”的、负责调控基因表达的区域上,增强与重编程过程相关的基因的表达。麻省理工学院的干细胞生物学家鲁道夫· 詹尼施(Rudolf Jaenisch)认为,“山中因子”与染色体的结合是“杂乱无章”的。 

 

也有研究指出,在重编程的早期阶段,细胞的染色体也会发生全面变化。在2011年发表的一项研究中,迈斯纳的研究小组发现,一种名为H3K4me2的组蛋白修饰在细胞基因组的1 000多个位点上发生了变化:这种修饰出现在了“多能性基因”的多个位点上,而在成纤维细胞的特异性基因上,这种修饰消失了。与此同时,细胞的外观和行为特征也出现不同:细胞之间更紧凑,移动较少。 

 

迈斯纳表示:“我们最初的想法是,‘山中因子’会造成混乱,但从我们的研究来看,重编程的第一阶段是可以预见的,而且在所有类型的细胞中是一致的。”现在,他几乎可以预见某个细胞类型在重编程过程中,“哪些位点可能被激活,哪些可能被修饰,而哪些将保持沉默,”他同时表示,“我们可以预测这部分。但是,这并不能回答接下来会发生什么”。 

 

第一阶段结束之后,为期一周的停滞阶段让科学家感到非常迷惑。在这一阶段,细胞仍在发生变化,有的还会表达新基因,但这时的细胞行为很难预测,也很难理解。甚至迈斯纳等人观测到的H3K4me2修饰,也要在这一阶段较晚的时候,才能增强基因的表达。“大多数细胞会进入部分重编程的状态。有些细胞则更接近重编程状态,我们还不清楚为什么会这样,”迈斯纳说,“这是一个‘黑匣子’”。然而,如果一个细胞开始合成SOX-2蛋白,就是一个好的迹象。“一旦SOX-2出现,重编程就进入正轨了,”詹尼施说(他研究过细胞近50个基因在重编程过程中的活动)。几天之内,SOX-2蛋白等与多能性有关的转录因子产量就会迅速上升。 

 

但是,这个过程为什么要花费如此长的时间?效率又如此低呢?“我们还不清楚为什么不能更快,” 沃尔特詹认为,一个细胞可能需要经过几次分裂,每次至少需要半天,以便改变DNA上的表观遗传标记。“也许,这是限制因素之一”。

 

关于低转化率,山中伸弥提出了几种可能的解释。一是,起始细胞包含各种类型,例如,研究人员采集的、用于提取成纤维细胞的组织,可能混杂了很多互有细微差异的细胞;而即便都是成纤维细胞,彼此也不尽相同,它们的蛋白质和分子也各有差异。此外,在体外培养时,细胞状态也会时常发生变化。这意味着,重编程因子对每个细胞造成的影响都是不同的。“对一部分细胞有效,并不意味着对其他的也有效,”山中伸弥说。此外,细胞的培养基,细胞之间的相互作用都可能存在差异,这就使研究人员难以控制所有变量。“要让细胞之间完全同步是不可能的”。 

 

目前,研究人员试图为完成了重编程的细胞分类,努力完善重编程技术,弄清楚重编程是怎么发生的,从哪一个阶段发生的。沃尔特詹已经发现,4个重编程因子的组合比例,会影响iPS细胞的产出。比如,某种比例下,重编程的成功率可能比较高,但最终结果不甚理想,细胞只进入了部分重编程的状态,且状态不稳定;而另一种比例虽然效率较低,得到的iPS细胞的质量却很高。 

 

“宏伟项目”的研究也证明,不同的变量,会产生完全不同的iPS细胞。在纳吉的推动下,“宏伟项目”发起于2010年,来自8个研究机构的30名科学家参加了该项目,目的就是要打开生物学上的这个“黑匣子”。纳吉说:“我想知道那里面有什么。”用山中因子触发重编程后,研究人员在1个月里每天收集1亿个细胞,然后定期分析细胞的蛋白质、RNA、甲基化状态的改变等,然后将分析产生的海量数据分发给世界各地的合作者。纳吉说,该项目的名字就来源于项目规模,“当我意识到我们已经收集了多少信息之后,就想出了这个名字。毫不夸张地说,这是一项宏伟的事业。”

 

打开“黑匣子” 

最近的一个重要发现是一种新的多能干细胞,称为F级细胞(F-class cell),它们的外观毛茸茸的。研究人员对重编程方法进行了微调,就产生了这些细胞:研究人员并没有像之前那样,只在重编程开始后的前几天引入重编程因子,而是持续加入。“这就导致了不同的结果,”纳吉说。  

 

F级细胞与iPS细胞不同,因为前者未能通过最严格的多能性测试之一:注射到小鼠胚胎后,它们不能由此发育成小鼠组织。出于这个原因,一些批评者说,F级细胞可能是其他科学家所说的“部分重编程”细胞。但纳吉认为,这类细胞没有发育成组织不代表它们没有多能性,因为它们拥有其他多能性特征:例如,它们会形成畸胎瘤,而其中包含多种类型的细胞。 

 

纳吉指出,其他人都忽略了F级状态,因为他们只是在寻找类似于胚胎干细胞的细胞,而他的团队“在多能性这个问题上是无偏见的”。他认为,可能有更多的多能性状态会被发现,而他和同事也会在海量数据中寻找这些状态。“这在概念上是很重要的,它开辟了另一扇大门”。 

 

这些研究,让科学家在重编程的核心问题上争论得越来越激烈:重编程过程是否本身就有随机的、不可预测的因素?直到最近,科学家才达成普遍的共识:重编程确实是随机的。根据该“随机”模式,重编程因子触发分子事件后,一些细胞将进入重编程状态,一些不会——后者的去向无法预测。 

 

但在一些研究,包括汉纳的一项研究都表明,重编程方法可以调整,使这一过程更加高效—— 这表明随机性可以控制甚至消除。这些研究意味着,重编程可以从一个随机过程转变为确定性的过程。 

 

许多科学家说,现在重编程过程中既有确定性的阶段(开始和结束),也有随机的阶段(中间神秘的一周)。对于这种争论,汉纳轻描淡写,在他看来重编程的随机性和确定性并没有矛盾。他把重编程比作掷硬币:每次掷硬币的结果都是随机的,但掷上100次,人像那面朝上的比例接近50%。类似的,任何一个细胞进入重编状态都是随机的,但随着时间的推移,重编程技术每次能产生的多能细胞将到达一个确定的百分比(或许是10%)。扎雷特表示,进一步研究将解决这些争论,弄清楚是什么因素让细胞跳出一周的停滞期。 

 

对于扎雷特而言,关于重编程的争论引出了更重要的问题:引发随机性的生物学规则是什么。“细胞系统本身是构建在一些‘固有噪音’和随机事件之上的,而这些因素会在一定程度上将细胞引向确定的命运方向。细胞的命运并没有因为随机事件而变来变去,”他说。这个问题是涉及细胞类型的基础,这也吸引着他开展研究。 

 

而对于其他人,比如山中伸弥,打开“黑匣子”的目的很实际:更高效的重编程能使实验完成得更好,得到更可靠的细胞来源,最终用于疾病治疗。“我的研究动机就是给病人治病,任何有助于推动iPS细胞进入临床的研究都让我感到兴奋。” 

 

本文作者 戴维·西拉诺斯基是《自然》驻中国上海的记者。

 

本文来自《环球科学》2015年第2期,转载请注明出处。

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